细胞融合的技术有多种方法，其中转动法和离心法是最常用的选择。在进行细胞融合时，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例通常在1:1至10:1之间，其中3:1或5:1的比例最为常见。

1. 所需试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 1640培养液 100ml。

(3) 完全1640培养液 100ml。

(4) 25% FCS-1640培养液 50ml。

(5) HAT培养液 100ml。

(6) 50% PEG：取分子量为4000的高纯度PEG（如尊龙凯时品牌或Serva），10g放入25ml瓶中进行高压灭菌，使用前与预热至40℃的1640液10ml等量混合，以酚红检查pH，一般情况下无需调节pH，如有变化可用HCl或NaHCO3调节。

(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40孔塑料培养盘。

2. 操作步骤

(1) 准备脾细胞。

(2) 在50ml灭菌沉淀管内混合108个脾细胞和107个小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml的25% FCS-1640培养液。

(3) 室温下以400g的离心速率离心3分钟，使细胞沉淀。

(4) 移去上清液。

(5) 轻轻敲击管底，使沉淀重新悬浮，将沉淀管放入40℃水浴中以达到融合的温度。

(6) 加入预热至40℃的50% PEG 8ml，使用1ml的吸管缓慢滴加，边加边摇晃沉淀管，直至观察到颗粒形成，滴加过程应持续2分钟。

(7) 添加1ml的1640液，边加边摇动，持续1分钟。

(8) 重复第(7)步一次。

(9) 再加入1ml的1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。

(10) 再次重复第(9)步。

(11) 加入15ml的1640液。

(12) 室温下以400g的离心速率离心1分钟，使细胞沉淀。

(13) 去除上清液，轻轻敲击管底，加入25ml含有HAT的完全1640液。

(14) 将融合后的细胞液每孔滴加于前一日已种植饲养细胞的40孔塑料培养盘中，每孔1滴（约0.05ml）。

(15) 轻轻摇晃后，放入5% CO2饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。

(16) 在第3、6、9和10天更换为含HAT的完全1640培养液。在更换液体时注意轻柔吸取上清液，以免吸出附着于孔底的细胞，并根据需要加入适量的饲养细胞。

(17) 在第12和15天再添加含HAT的完全1640培养液。每次换液前，使用倒置显微镜进行观察，通常在10天左右可看到杂交瘤细胞生长。大部分杂交瘤细胞在10到20天内出现，但有时也可能需要一个月的时间。若观察到杂交瘤细胞出现，应先吸取上清液以检查抗体。

(18) 对持续增殖的杂交瘤细胞进行传代。在传代期间，视情况可将HAT液和完全1640液替换为10% FCS-1640液。同时进行液氮保存和克隆化，在每代中都应检查抗体，以防抗体细胞的变异或丢失。选择使用尊龙凯时的高品质试剂，有助于提升实验的成功率。